Diagnóstico Molecular de Doenças Infecciosas

O diagnóstico de vários processos infecciosos, por muito tempo se constituiu num desafio, quando a caracterização etiológica se fazia necessária. Isto acontecia, não só pela escassez de laboratórios centrais de referência para estas enfermidades, mas também pela falta de testes diagnósticos rápidos e sensíveis.

Muitas vezes, uma variedade de meningites e encefalites assépticas deixavam de ter um diagnóstico etiológico, pela ausência de um padrão ouro adequado. A biópsia cerebral é ainda considerada o padrão ouro no diagnóstico das encefalites virais, mas é pouco utilizada pela sua natureza invasiva. O isolamento viral do liquido cefalorraquidiano (LCR) em cultura celular tem se mostrado ineficiente para a maioria das meningites e encefalites virais, por ser um método muito lento e pouco sensível. Normalmente, os achados laboratoriais são pouco elucidativos, e os testes sorológicos específicos disponíveis oferecem um diagnóstico retrospectivo, e não adequados para pacientes sob imunossupressão.

A emergência do vírus da imunodeficiência humana (HIV) aumentou a necessidade de testes laboratoriais mais sensíveis, mais rápidos e menos invasivos para diagnosticar as conseqüências secundárias desta patologia: as infecções oportunistas. Aproximadamente 40% dos pacientes com SIDA desenvolverão manifestações neurológicas importantes durante o curso da doença (Levy, 1984). Estes processos infecciosos podem ser provocados pelo próprio HIV ou por uma série de agentes oportunistas tais como Toxoplasma gondii, vírus JC (JCV), citomegalovírus (CMV), vírus da varicela zoster (HZV), vírus do Herpes simplex (HSV), vírus do Epstein-Barr (EBV), micobactérias, vírus do herpes humano tipo 6 (HHV-6), além de alguns fungos e outras bactérias. Estas síndromes se apresentam com sinais e sintomas inespecíficos e variados, podendo ocorrer múltiplos processos patológicos no SNC de um mesmo paciente, assim, se tornando quase impraticável o diagnóstico clínico. No contexto destas limitações, testes de amplificação de ácidos nucléicos, em especial de PCR, têm sido exaustivamente avaliados no diagnóstico das infecções virais.

Com o advento dos quimioterápicos específicos, uma identificação acurada e precoce do agente causal da infecção tem sido necessária para um melhor manejo do paciente, além de permitir ações de saúde pública, quando necessário.

O desenvolvimento da técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) por Kary Mullis e colegas, em meados de 1980, revolucionou a análise de ácidos nucléicos, permitindo a amplificação in vitro de seqüências específicas do material genético. A PCR baseia-se no mecanismo natural da duplicação do material genético que ocorre sempre que uma célula se divide para formar duas novas. A reação ocorre em tubo de ensaio que deve conter o DNA alvo a ser pesquisado, os iniciadores, oligonucleotídeos, primers ou iniciadores que são fragmentos sintéticos de fita simples de DNA, complementares à seqüência alvo do DNA pesquisado, desoxinucleotídeos trifosfato, enzima termoestável DNA polimerase e soluções tampão. A reação acontece em um equipamento chamado termociclador e consiste de um ciclo com três etapas onde as temperaturas de incubação variam. Na 1ª etapa a temperatura da reação atinge 90-95 ºC, ocorrendo a desnaturação da fita dupla de DNA. Na 2ª etapa a temperatura baixa em torno de 40-65 ºC para permitir o acoplamento dos iniciadores e na 3ª etapa, a temperatura é elevada a 72 ºC acontecendo a extensão dos primers promovida pela enzima Taq polimerase que forma fitas sintéticas idênticas ao segmento alvo. Este ciclo de três etapas é repetido em torno de 30 vezes e os fragmentos de DNA recém formados, servem de molde para a síntese de novas fitas no ciclo seguinte. A reação é exponencial, o número de fragmentos de DNA se duplica a cada ciclo e, após 30 ciclos, teremos mais de um milhão de cópias (Mullis, 1990).

A PCR tem sido amplamente utilizada nas mais diferentes áreas da pesquisa biológica, entretanto, o maior impacto tem sido no diagnóstico das doenças infecciosas, principalmente naquelas causadas por microrganismos não cultiváveis, com crescimento lento, ou que exigem meios de cultura altamente especializados como vírus, determinadas bactérias, fungos e protozoários. A PCR possibilita a análise de um maior número de patógenos de maneira mais rápida e precisa (Eisenstein , 1990).

Os métodos moleculares são rápidos e sensíveis para a detecção viral, e em algumas etiologias, já estão sendo considerados os testes de escolha, como na encefalite herpética, onde a biópsia cerebral já foi suplantada pela PCR (Lakeman, 1995). O emprego de técnicas de neuroimagem em combinação como a PCR podem descartar a biópsia cerebral em algumas situações de doenças focais do SNC (Skiest, 2002). Uma das vantagens mais importantes destes testes é a rapidez na obtenção dos resultados.

Pacientes sob imunossupressão, tais como transplantados de fígado, rim e medula e pacientes oncológicos, também se beneficiam do diagnóstico molecular, pois a utilização de testes sorológicos possui aplicação limitada, já que a produção de anticorpos contra antígenos não é eficiente.

Recém nascidos podem apresentar anticorpos do tipo IgG maternos transferidos passivamente durante a gestação. Assim, técnicas sorológicas que pesquisam anticorpos IgG não são adequadas e a pesquisa de anticopos do tipo IgM, em muitos casos, não é elucidativa para o diagnóstico das infecções neonatais. A detecção do DNA do agente infeccioso tem sido empregada nestes casos, tanto no sangue periférico quanto no líquor da criança. A PCR também tem diagnosticado casos de infecções intra-uterinas através da amplificação do DNA patogênico no líquido amniótico.

A amplificação de seqüências genômicas virais específicas, por PCR, tem auxiliado no diagnóstico das hepatites B e C, nos casos em que a pesquisa de anticorpos IgG para estes vírus se apresenta positiva ou duvidosa.

A utilização da PCR no diagnóstico microbiológico, além de amplificar o DNA do agente causal da infecção, diretamente da amostra, oferece a possibilidade de tipar o microrganismo, fornecer dados sobre a patogênese, epidemiologia e tratamento da doença. Pode-se ainda monitorar o tratamento pela quantificação do patógeno e detectar mutações que conferem resistência às drogas, por amplificar seqüências distintas do genoma (Louie, 2000).

A purificação do material genético é uma etapa de pré PCR de fundamental importância para obter-se DNA ou RNA de boa qualidade para a amplificação.

A PCR empregada no diagnóstico das doenças infecciosas no CDG é a nested PCR ou PCR dupla in house, e foi validada clinica e laboratorialmente com diversos estudos (Chesky, 1998; Chesky, 2000; Burin, 2004; Peres, 2005; Failace 2005). A PCR dupla emprega dois pares de iniciadores diferentes, um par em cada reação e o produto da primeira reação serve de amostra para a segunda, conferindo maior sensibilidade e especificidade ao exame. O método de detecção dos fragmentos amplificados da PCR usa eletroforese em gel de agarose a 2% com brometo de etídio e visualização em transiluminador UV. Os produtos formados são comparados com controles positivos ou marcador de peso molecular e os resultados reportados como positivo (presença de DNA) e negativo (ausência de DNA).